(Revogado pela Instrução Normativa MAPA Nº 30 DE 26/06/2018):

O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, DO MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe conferem os arts. 9º e 42, do Anexo I, do Decreto nº 5.351, de 21 de janeiro de 2005, e tendo em vista o que consta do Processo nº 21000.002566/2007-21, resolve:

Art. 1º Aprovar os Métodos Analíticos Físico-Químicos para Detecção da Maltodextrina em Leite, em conformidade com o Anexo desta Instrução Normativa, determinando que sejam utilizados nos Laboratórios Nacionais Agropecuários.

Art. 2º Esta Instrução Normativa entra em vigor na data de sua publicação.

INÁCIO AFONSO KROETZ

ANEXO - MÉTODOS ANALÍTICOS FÍSICO-QUÍMICOS PARA DETECÇÃO DA MALTODEXTRINA EM LEITE

MÉTODO A

1. Princípio

A cromatografia em camada fina é aplicável para identificação de dissacarídeos ou oligossacarídeos. A cromatografia em placa, utilizando solventes e reveladores apropriados, permite a identificação eluindo-se as manchas na camada delgada e determinando colorimetricamente a presença ou ausência de carboidratos de interesse. Podem-se identificar os carboidratos por comparação dos valores de fatores de retenção (Rf) com padrões usados paralelamente na análise. A solução reveladora para os carboidratos é o a-naftol em etanol e ácido sulfúrico. A solução reveladora promoverá a formação de furfural ou seus derivados, por desidratação dos carboidratos, seguido da condensação com o a-naftol, produzindo composto de cor violeta, de composição incerta, e marrom, conforme o peso molecular e estrutura tridimensional do oligossacarídeo.

2. Material

2.1. Equipamentos:

Agitador magnético;

Balança analítica;

Estufa;

Secador de cabelo; e

Placa cromatográfica de Sílica Gel 60 F254 de 20x20cm.

2.2. Vidraria, utensílios e outros:

Balões volumétricos de 100mL;

Barra magnética;

Béquer de 250mL;

Cuba cromatográfica;

Erlenmeyer de 250mL;

Funil de vidro;

Lápis;

Microsseringa; e

Papel de filtro qualitativo.

2.3. Reagentes:

a-Naftol (C10H8O7);

1-Propanol (C3H8O);

Acetato de etila (C3H8O2);

Acetato de zinco diidratado (ZnC4H6O4.2H2O) ou sulfato de zinco heptaidratado (ZnSO4.7H2O);

Acetonitrila (C2H3N);

Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4);

Etanol (C2H6O);

Ferrocianeto de potássio triidratado (K4[Fe(CN)6].3H2O);

Lactose monoidratada (C12H22O11);

Maltodextrina tipo indutrial;

Maltose monoidratada (C12H22O11); e

Sacarose (C12H22O11).

3. Procedimentos

3.1. Preparo de soluções

3.1.1. Solução de acetato ou sulfato de zinco 30%

Em béquer de 1.000mL, pesar 300g de acetato ou sulfato de zinco, adicionar 400mL de água deionizada destilada. Agitar com auxílio de agitador magnético até a completa dissolução. Transferir para balão volumétrico de 1.000mL, completar o volume e homogeneizar.

3.1.2. Solução de ferrocianeto de potássio 15%

Em béquer de 1.000mL, pesar 150g de ferrocianeto de potássio, adicionar 600mL de água deionizada destilada. Agitar com auxílio de agitador magnético até a completa dissolução. Transferir para balão volumétrico de 1.000mL, completar o volume e homogeneizar.

3.1.3. Fase móvel

Em béquer de 400mL, adicionar 85mL de acetonitrila, 20mL de acetato de etila, 50mL de 1-propanol e 65mL de água.

3.1.4. Solução reveladora Dissolver 1g de a-naftol em 200mL de etanol e acrescentar 10mL de ácido sulfúrico concentrado.

3.1.4. 1. Preparo dos padrões

3.1.4.2. Padrão de lactose 0,5%

Pesar 0,5g de lactose e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.1.4.3. Padrão de maltose 0,5%

Pesar 0,5g de maltose e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.1.4.4. Padrão de maltodextrina 0,5%

Pesar 0,5g de maltodextrina e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.1.4.5. Padrão de sacarose 0,5%

Pesar 0,5g de sacarose e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.2. Preparo das amostras e tratamento

3.2.1. A partir de leite fluido

Em béquer de 250mL, adicionar 100mL de leite fluido.

Acrescentar 5mL de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e agitar com auxílio de agitador magnético. Acrescentar 5mL de solução de acetato ou sulfato de zinco a 30% e homogeneizar. Deixar decantar, filtrar em papel de filtro e receber o filtrado em erlenmeyer de 250mL.

3.2.2. A partir de leite em pó integral

Pesar 13g de leite em pó integral em béquer de 250mL e acrescentar 100mL de água deionizada destilada. Agitar com auxílio de agitador magnético até a completa dissolução. Acrescentar 5mL de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e homogeneizar. Acrescentar 5mL de solução de acetato ou sulfato de zinco a 30% e homogeneizar. Deixar decantar, filtrar em papel de filtro e receber o filtrado em erlenmeyer de 250mL.

3.2.3. Preparo do branco

Em béquer de 250mL, adicionar 100mL de leite fluido isento de maltodextrina e de açucares (maltose e sacarose). Acrescentar 5mL

de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e agitar com auxílio de agitador magnético. Acrescentar 5mL de solução de acetato ou sulfato de zinco a 30% e homogeneizar. Deixar decantar, filtrar em papel de filtro e receber o filtrado em erlenmeyer de 250 mL.

3.3. Procedimentos analíticos

3.3.1. Preparo da placa cromatográfica

Marcar a placa com auxílio de lápis de tal forma a ter 20 pontos eqüidistantes a 2cm da extremidade inferior da placa. Identificar cada marcação em que será aplicado as amostras. Marcar também o final da corrida em torno de 17cm da extremidade inferior da placa.

3.3.2. Aplicação das amostras e dos padrões

Aplicar, em cinco pontos, 3µL (microlitros) do branco e dos padrões preparados (lactose, maltodextrina, maltose e sacarose). Usar secador de cabelo para evitar que o diâmetro das aplicações ultrapasse 5mm. Em seguida, aplicar o filtrado das amostras preparadas.

3.3.3. Preparo da cuba cromatográfica

Adicionar volume suficiente de fase móvel para realização da corrida e tampar. Deixar equilibrar por, no mínimo, 60minutos. Em seguida, inserir a placa cromatográfica com as amostras e padrões aplicados.

3.3.4. Corrida cromatográfica

Deixar a corrida cromatográfica ocorrer por cerca de duas ou até alcançar a marca feita para o final da corrida. Em seguida, remover a placa e secar em estufa a 60ºC por cerca de 15 minutos.

3.3.5. Revelação

Imergir completamente a placa na solução reveladora até que ela fique toda molhada. Retirar imediatamente. Secar com auxílio do secador de cabelo. Em seguida, colocar a placa em estufa a 120º C por cerca de 20 minutos, ou até aparecerem as manchas características da reação do a-naftol com os açúcares. Medir os fatores de retenção (Rf).

4. Cálculos e expressão dos resultados

4.1. Fatores de retenção (Rf) para os dissacarídeos e as manchas das amostras contaminadas com maltodextrina

Calcular os Rf de cada dissacarídeo e das manchas.

Rf= Distância do composto à linha de origem Distância da frente de solvente à linha de origem

4.2. Identificação da presença de sacarose ou maltose

Fazer a identificação da presença de sacarose ou maltose por comparação dos fatores de retenção das manchas na amostra e nos padrões utilizados.

4.3. Identificação da presença de maltodextrina

Fazer a identificação da presença de maltodextrina por comparação dos fatores de retenção das manchas nas amostras e no padrão de maltodextrina utilizado.

4.4. Expressão dos resultados

Os resultados das amostras devem ser expressos como positivo ou negativo para a presença de sacarose, maltodextrina e maltose.

BIBLIOGRAFIA

BRANDÃO, S.C.C.; VIANA, G.A. SILVA, C.A.O.; MARTINS, F.O. Desenvolvimento de metodologia analítica por cromatografia em camada fina para determinar adulteração do leite com maltodextrina. Indústria de Laticínios, ano VIII, n. 50, p. 62-69, mar/abr, 2004.

ROBYT, J.F.; MUKERJEA, R. Separation and quantitative determination of nanogram quantities of maltodextrins and isomaltodextrins by thin-layer chromatography. Carbohydrate Research,

MÉTODO B

1. Princípio

A cromatografia em camada fina é aplicável para identificação de dissacarídeos ou oligossacarídeos. A cromatografia em placa, utilizando solventes e reveladores apropriados, permite a identificação eluindo-se as manchas na camada delgada e determinando colorimetricamente a presença ou ausência de carboidratos de interesse. Podem-se identificar os carboidratos por comparação dos valores de fatores de retenção (Rf) com padrões usados paralelamente na análise. A solução reveladora para os carboidratos é o a-naftol em etanol e ácido sulfúrico. A solução reveladora promoverá a formação de furfural ou seus derivados, por desidratação dos carboidratos, seguido da condensação com o a-naftol, produzindo composto de cor violeta, de composição incerta, e marrom, conforme o peso molecular e estrutura tridimensional do oligossacarídeo.

2. Material

2.1. Equipamentos:

Agitador magnético;

Balança analítica;

Estufa;

Secador de cabelo; e

Placa cromatográfica de Sílica Gel 60 F254 de 20x20cm.

2.2. Vidraria, utensílios e outros:

Balões volumétricos de 50mL;

Barra magnética;

Béquer de 250mL;

Borrifador para uso em cromatografia de camada delgada (CCD);

Cuba cromatográfica;

Erlenmeyer de 125mL;

Funil de vidro;

Lápis;

Microsseringa;

Negatoscópio (opcional);

Papel de filtro qualitativo; e

Pipeta volumétrica de 20mL.

2.3. Reagentes:

a-Naftol (C10H8O7);

Acetato de zinco diidratado (ZnC4H6O4.2H2O) ou sulfato de zinco heptaidratado (ZnSO4.7H2O);

Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4);

Etanol (C2H6O);

Ferrocianeto de potássio triidratado (K4[Fe(CN)6].3H2O);

Lactose monoidratada (C12H22O11);

Maltodextrina tipo indutrial; e

Sacarose (C12H22O11).

3. Procedimentos

3.1. Preparo de soluções

3.1.1. Solução de acetato ou sulfato de zinco 30%

Em béquer de 1.000 mL, pesar 300g de acetato ou sulfato de zinco, adicionar 400mL de água deionizada destilada. Agitar com auxílio de agitador magnético até a completa dissolução. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL, completar o volume e homogeneizar.

3.1.2. Solução de ferrocianeto de potássio 15%

Em béquer de 1.000 mL, pesar 150g de ferrocianeto de potássio, adicionar 600mL de água deionizada destilada. Agitar com auxílio de agitador magnético até a completa dissolução. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL, completar o volume e homogeneizar.

3.1.3. Fase móvel

Em béquer de 400mL, adicionar 150mL de etanol e 50mL de água.

3.1.4. Solução reveladora

Dissolver 1g de a-naftol em 200mL de etanol e acrescentar 10mL de ácido sulfúrico concentrado.

3.1.4. 1. Preparo dos padrões

3.1.4.2. Padrão de lactose 5mg/mL

Pesar 0,5g de lactose e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.1.4.3. Padrão de maltodextrina 5mg/mL

Pesar 0,5g de maltodextrina e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.1.4.4. Padrão de sacarose 5mg/mL

Pesar 0,5g de sacarose e transferir com auxílio água para balão volumétrico de 100mL. Agitar até completa dissolução. Completar o volume e homogeneizar.

3.2. Preparo das amostras e tratamento

3.2.1. A partir de leite fluido

Em balão volumétrico de 50mL, adicionar 20mL de leite fluido com auxílio de pipeta volumétrica. Acrescentar 2mL de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e homogeneizar por rotação. Acrescentar 2mL de solução de acetato ou sulfato de zinco a 30% e homogeneizar por rotação. Completar o volume e deixar decantar. Filtrar em papel de filtro e receber o filtrado em erlenmeyer de 125mL.

3.2.2. A partir de leite em pó

Pesar 10 g de leite em pó desnatado ou 13g de leite em pó integral, acrescentar 100mL de água com auxílio de uma proveta e agitar, com auxílio de agitador magnético, até a completa dissolução. Para leite parcialmente desnatado ou semidesnatado, verificar a forma de reconstituição de acordo com o fabricante. Após a reconstituição do leite, transferir 20mL, com auxílio de pipeta volumétrica, para balão volumétrico de 50mL. Acrescentar 2mL de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e homogeneizar por rotação. Acrescentar 2mL de solução de acetato ou sulfato de zinco a 30% e homogeneizar por rotação. Completar o volume e deixar decantar. Filtrar em papel de filtro e receber o filtrado em erlenmeyer de 125mL.

3.2.3. Preparo do branco

Em balão volumétrico de 50mL, adicionar 20mL de leite fluido ou reconstituído com auxílio de pipeta volumétrica. Acrescentar 2mL de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e homogeneizar por rotação. Acrescentar 2mL de solução de acetato ou sulfato de zinco a 30% e homogeneizar por rotação. Completar o volume e deixar decantar. Filtrar em papel de filtro e receber o filtrado em erlenmeyer de 125mL.

3.3. Procedimentos analíticos

3.3.1. Preparo da placa cromatográfica Marcar a placa com auxílio de lápis de tal forma a ter 20 pontos eqüidistantes a 2cm da extremidade inferior da placa. Identificar cada marcação em que será aplicado as amostras. Marcar também o final da corrida em torno de 17cm da extremidade inferior da placa.

3.3.2. Aplicação das amostras e dos padrões

Aplicar, em cinco pontos, 4µL (microlitros) do branco e dos padrões preparados (lactose, maltodextrina, maltose e sacarose). Usar secador de cabelo para evitar que o diâmetro das aplicações ultrapasse 5mm. Em seguida, aplicar o filtrado das amostras preparadas.

3.3.3. Preparo da cuba cromatográfica

Adicionar volume suficiente de fase móvel para realização da corrida e tampar. Deixar equilibrar por, no mínimo, 60minutos. Em seguida, inserir a placa cromatográfica com as amostras e padrões aplicados.

3.3.4. Corrida cromatográfica

Deixar a corrida cromatográfica ocorrer por cerca de duas ou até alcançar a marca feita para o final da corrida. Em seguida, remover a placa e secar em estufa a 60ºC por cerca de 15 minutos.

3.3.5. Revelação e identificação das manchas

Com auxílio do borrifador, espalhar a solução reveladora de forma homogênea até que ela fique toda molhada. Secar com auxílio do secador de cabelo. Em seguida, colocar a placa em estufa a 120ºC por cerca de 20 minutos, ou até aparecerem as manchas características da reação do a-naftol com os açúcares. A observação das manchas pode ser feita com auxílio de luz forte ou do negatoscópio. Medir os fatores de retenção (Rf).

4. Cálculos e expressão dos resultados

4.1. Fatores de retenção (Rf) para os dissacarídeos e as manchas das amostras contaminadas com maltodextrina

Calcular os Rf de cada dissacarídeo e das manchas.

Rf= Distância do composto à linha de origem

Distância da frente de solvente à linha de origem

4.2. Identificação da presença de sacarose

Fazer a identificação da presença de sacarose por comparação dos fatores de retenção das manchas na amostra e nos padrões utilizados.

4.3. Identificação da presença de maltodextrina

Fazer a identificação da presença de maltodextrina por comparação dos fatores de retenção das manchas nas amostras e no padrão de maltodextrina utilizado.

4.4. Expressão dos resultados

Os resultados das amostras devem ser expressos como positivo ou negativo para a presença de sacarose e maltodextrina.

BIBLIOGRAFIA

BRANDÃO, S.C.C.; VIANA, G.A. SILVA, C.A.O.; MARTINS, F.O. Desenvolvimento de metodologia analítica por cromatografia em camada fina para determinar adulteração do leite com maltodextrina. Indústria de Laticínios, ano VIII, n. 50, p. 62-69, mar/abr, 2004.

ROBYT, J.F.; MUKERJEA, R. Separation and quantitative determination of nanogram quantities of maltodextrins and isomaltodextrins by thin-layer chromatography. Carbohydrate Research,