(Revogado pela Instrução Normativa MAPA Nº 30 DE 26/06/2018):

Anexo - Continuação ao Anexo VIII

CAPÍTULO XI - NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE Staphylococcus aureus

1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a determinação do NMP de Staphylococcus aureus em alimentos.

Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitação determinados pela legislação encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL.

2. FUNDAMENTOS

2.1 Determinação do NMP

Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10%- piruvato de sódio 1% (TSB-NP), com posterior confirmação em ágar Baird-Parker.

No caldo TSB-NP, a alta concentração de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o crescimento de microbiota acompanhante que não apresente capacidade de se desenvolver nesta condição.

O Staphylococcus aureus reduz, anaeróbia e aerobiamente, o telurito de potássio, produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colônias negras no ágar Baird-Parker.

O ágar Baird-Parker, enriquecido com solução de gema de ovo, possibilita a evidenciação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitação e um de transparência ao redor da colônia.

Prova da coagulase

Baseia-se na comprovação da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho pela ação da enzima coagulase.

2.3 Provas complementares

2.3.1 Coloração de Gram

Baseia-se na verificação das características morfológicas e tintoriais do microrganismo.

2.3.2 Prova da termonuclease

Baseia-se na degradação do DNA em oligonucleotídeos pela ação da enzima DNAse produzida pelo microrganismo.

A reação é evidenciada pelo aparecimento de um halo de coloração rósea no ágar azul de toluidina e de clarificação, quando utilizado o ágar para teste de DNAse com verde de metila.

2.3.3 Prova da catalase

Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas.

2.4 Limitações do Método

A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitações quanto à especificidade, devido ao fato de algumas espécies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, também serem coagulase positivas.

Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reação na prova da coagulase. Além disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reação de termonuclease positiva.

3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;

Ágar Baird-Parker-base;

Ágar azul de toluidina - DNA ou Ágar para ensaio de DNAse com verde de metila;

Ágar estoque;

Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sódio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC);

Caldo cérebro-coração (BHI);

Solução salina peptonada 0,1%;

Solução salina 0,85%;

Solução de azul de toluidina 1%;

Emulsão de gema de ovo a 50%;

Telurito de potássio 3,5%;

Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;

Peróxido de hidrogênio 3%;

Etanol 70% ou Etanol 70º GL;

Reagentes para coloração de Gram.

4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.

5. PROCEDIMENTOS

5.1 Pesagem e preparo da amostra

5.1.1 Alimentos sólidos

Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.

Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.

Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher.

Esta é a diluição 10-1.

A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, "Diluições e soluções", deste Manual.

Inocular 1 mL de cada diluição selecionada em três séries de três tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSBNP.

Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 mL de selo estéril (vaspar, vaselina, óleo mineral ou parafina líquida, estéreis e previamente fundidos).

5.1.2 Alimentos líquidos

Pipetar 1 mL diretamente da amostra e transferir para cada um dos três tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP.

Transferir também 1 mL da amostra para um tubo contendo 9 mL de solução salina peptonada 0,1% (diluição 10-1).

A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, "Diluições e soluções", deste Manual.

Inocular 1 mL das duas diluições subseqüentes em séries de três tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP.

Adicionar uma camada de 1 a 2 mL de selo estéril (vaspar, vaselina, óleo mineral ou parafina líquida, estéreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC.

5.2 Procedimentos de controle

Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.

5.3 Incubação

Incubar a 36 ± 1ºC por 48 horas.

5.4 Leitura

Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento do meio ou precipitado negro em caldo GC e turvação em caldo TSB-NP.

5.5 Provas confirmatórias

Com pipetas de Pasteur estéreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e colocá-la sobre a superfície seca de ágar Baird-Parker, junto à borda da placa, estriando posteriormente com alça, de forma a obter colônias isoladas.

A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvação, com auxílio de alça de platina ou níquel-cromo, repicar sobre a superfície seca de ágar Baird-Parker.

Incubar a 36 ± 1ºC por 30 a 48 horas.

Selecionar de 2 a 3 colônias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitação e/ou rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cada colônia para um tubo contendo caldo BHI.

Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase.

5.5.1 Prova da coagulase

Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho.

Incubar a 36 ± 1ºC, por 6 horas.

Verificar a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir:

Reação negativa: não formação de coágulo;

Reação 1+: coágulo pequeno e desorganizado;

Reação 2+: coágulo pequeno e organizado;

Reação 3+: coágulo grande e organizado;

Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo que não se desprenderá quando o tubo for invertido;

Quando a reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus;

Quando a reação de coagulação for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus;

Quando a reação for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo ágar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas para a realização dos testes complementares.

5.6 Testes complementares

A partir da cultura pura em caldo BHI ou ágar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:

5.6.1 Coloração de Gram

Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram.

A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares.

5.6.2 Pesquisa da termonuclease

Fazer orifícios eqüidistantes, com cerca de 2 mm de diâmetro, no ágar para ensaio da termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.

Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado.

Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas ou a 50 ± 2ºC por 2 horas.

O aparecimento de um halo rosa no ágar azul de toluidina ou de um halo de clarificação no ágar para ensaio de DNAse com verde de metila, será indicativo de reação positiva para termonuclease.

Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de diâmetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus é termonuclease positiva.

5.6.3 Prova da catalase

Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, estéreis, retirar uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.

Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.

A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase.

A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.

O Staphylococcus aureus é catalase positiva.

6. RESULTADOS

A partir da combinação de números correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, "Procedimentos básicos de contagem", deste Manual.

Certificar-se de que a tabela de NMP em uso é a indicada para cada caso específico.

Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL.

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

AOAC Official Method 987.09 Staphylococcus aureus in Foods: most probable number method for isolation and enumeration. In: Microbiological Methods. 17 ed., AOAC, Andrews, W.H. (Ed.), cap. 17.5.01, 1998.

BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov

BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos técnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lácteos. Ministério da Agricultura e do Abastecimento/Secretaria de Defesa Animal/Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal/Divisão de Normas Técnicas. Brasília, D.F. Série regulamentação técnica de identidade e qualidade de produtos de origem animal; n.2. 1997, 77p.

GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 863-912.

HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256.

LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403.

MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bactérias de importância clinica. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60.

MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p.

CAPÍTULO XII
NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a determinação do número mais provável de Vibrio parahaemolyticus.

Aplica-se a amostras de pescado e derivados.

2. FUNDAMENTOS

2.1 Provas presuntivas

2.1.1 Enriquecimento em caldo seletivo

Inoculação em meio de cultura de enriquecimento seletivo:

caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em que a presença de Vibrio parahaemolyticus é evidenciada pela turvação do meio após a incubação.

Em sua composição, o meio GSTB apresenta teepol, solução aquosa de sulfatos de sódio alcalinos primários que atuam na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano.

Como o Vibrio parahaemolyticus é halófilo obrigatório, os dois meios contém 3% de cloreto de sódio.

2.1.2 Isolamento em ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS)

Isolamento se realiza em ágar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contém elevada concentração de tiossulfato e citrato de sódio, responsáveis pela inibição do crescimento das enterobactérias presentes.

A bile e o colato de sódio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formação de ácido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio.

2.2 Provas de identificação

A identificação de Vibrio parahaemolyticus é feita por meio de provas bioquímicas, sorológicas, morfológicas e tintoriais.

3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;

Ágar Müeller-Hinton sal 3%;

Ágar nutriente sal 3%;

Ágar gelatina sal 3%;

Ágar soja triptona sal 3%;

Ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS);

Ágar ferro três açúcares (TSI) sal 3% ou Ágar Kligler sal 3%;

Ágar motilidade sal 3%;

Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB);

Caldo peptonado sem sal;

Caldo peptonado sal 3%;

Caldo peptonado sal 6%;

Caldo peptonado sal 8%;

Caldo peptonado sal 10%;

Caldo ONPG sal 3%;

Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%;

Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%;

Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%;

Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%;

Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%;

Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%;

Solução salina peptonada 0,1% sal 3%;

Solução fisiológica (NaCl 0,85%);

Agente vibriostático O 129 10g;

Agente vibriostático O 129 150 g;

Arabinose;

L-arginina;

L-lisina;

Manitol;

Sacarose;

Óleo mineral ou parafina líquida estéreis;

Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina);

Teepol;

O-nitrofenil-â-D-galactopiranosídeo ou p-nitrofenil-â-D-galactosídeo;

Etanol 96%;

Reagentes para coloração de Gram.

4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.

5. PROCEDIMENTOS

5.1 Preparo e Pesagem

Preparar a amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.

Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%.

Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.

Esta é a diluição 10-1.

5.2 Procedimentos de controle

Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.

5.3 Provas presuntivas

5.3.1 Inoculação em caldo de enriquecimento seletivo

A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mínimo mais duas diluições) de acordo com as instruções contidas no Anexo II, "Diluições e soluções", deste Manual.

Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluições desejadas em séries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB.

5.3.2 Incubação

Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 18 horas a 24 horas.

5.3.3 Leitura

A presença de turvação do meio indica a suspeita da presença de Vibrio parahaemolyticus.

Anotar o número de tubos de cada série que apresentaram turvação.

5.3.4 Isolamento em ágar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS)

5.3.4.1 Inoculação

A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvação, sem agitá-lo e com auxílio de uma alça de níquel-cromo, de platina ou descartável estéril, retirar uma alçada do crescimento da superfície e estriá-la sobre a superfície seca de ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS).

5.3.4.2 Incubação

Incubar as placas em posição invertida a 36 ± 1ºC por 24 horas.

5.3.4.3 Leitura

Verificar o aparecimento de colônias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de diâmetro, típicas de Vibrio parahaemolyticus.

Quando não houver colônias suspeitas, o resultado será negativo para o tubo de origem.

5.4 Provas preliminares para identificação de Vibrio parahaemolyticus

De cada placa, selecionar de 2 a 3 colônias típicas e transferi-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e ágar nutriente sal 3% inclinado.

Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

5.4.1 Coloração de Gram

A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, proceder à coloração de Gram de acordo com as instruções descritas no Anexo VII, "Procedimentos de coloração", deste manual.

O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.

5.4.2 Crescimento com 8% de sal e sem sal

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, uma alçada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%.

Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

Após o período de incubação, verificar a presença de turvação indicativa da ocorrência de crescimento.

O Vibrio parahaemolyticus não cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal.

5.4.3 Prova da oxidase

A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plástico descartáveis, pipetas Pasteur, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponíveis.

Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após este tempo, podem ocorrer reações falso-positivas.

O aparecimento de cor azul (quando é usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado é o oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.

OBS.: Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva.

O Vibrio parahaemolyticus é oxidase positiva

5.4.4 Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxílio de alça de níquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%.

Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéreis.

Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

Após o período de incubação, observar a mudança de coloração do meio, de vermelho para amarelo, devido à fermentação da sacarose e produção de ácido.

O Vibrio parahaemolyticus não altera a coloração do meio pois não é capaz de fermentar a sacarose.

5.4.5 Ágar ferro três açúcares sal 3% (TSI) ou Ágar Kligler ferro sal 3%

A partir do cultivo mantido no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de platina ou níquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do ágar e estriando a superfície inclinada, tubos com ágar TSI sal 3% ou ágar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.

O Vibrio parahaemolyticus apresenta base ácida (amarela), sem gás, sem produção de H2S e bisel alcalino (vermelho).

5.4.6 Teste ONPG

A partir da cultura em TSI, inocular uma alçada espessa em tubo contendo 0,5 mL de caldo ONPG sal 3%.

Incubar em banho-maria a 36 ± 1ºC, durante 2 horas. Examinar os tubos, verificando o aparecimento ou não de cor amarela, indicativa de reação positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reação é negativa.

O Vibrio parahaemolyticus é ONPG negativo.

5.5 Provas adicionais para identificação de Vibrio parahaemolyticus

As colônias que apresentarem comportamento compatível com V. parahaemolyticus nas provas preliminares, deverão ser submetidas às provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9.

5.5.1 Teste do crescimento a 42ºC

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%.

Incubar a 42 ± 1ºC por 24 horas.

Após o período de incubação, observar a presença de turvação dos meios.

O Vibrio parahaemolyticus cresce à temperatura de 42ºC.

5.5.2 Ágar gelatina sal 3%

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular uma placa de Petri contendo ágar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em até 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada setor).

Incubar as placas a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

Colocar as placas em refrigeração por alguns minutos antes de realizar a leitura, o que facilita a vizualização do halo.

O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presença da gelatinase.

O Vibrio parahaemolyticus é gelatinase positiva.

5.5.3 Teste da motilidade

A partir da cultura mantida no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, através de picada central, inocular um tubo contendo ágar motilidade sal 3%.

Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.

Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva.

O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva.

5.5.4 Prova de Hugh-Leifson glicose (OF)

A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, inocular, com auxílio de agulha de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%.

Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.

Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

Após o período de incubação, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presença de bolhas de gás nos meios.

A cor amarela nos dois tubos significa fermentação da glicose.

A presença de cor amarela somente no tubo sem óleo mineral significa utilização oxidativa da glicose.

O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produção de gás, ou seja, os dois tubos devem apresentar coloração amarela.

5.5.5 Descarboxilação da lisina

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%.

Inocular também um tubo contendo meio base (sem adição do aminoácido) que servirá de controle.

Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.

Incubar a 36 ± 1ºC por, no máximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% não inoculado, que servirá de controle negativo.

Examinar os tubos todos os dias.

Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose, e, ocorrendo a descarboxilação da lisina, o meio retorna à cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono.

O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer.

O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina.

5.5.6 Hidrólise da arginina

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%.

Inocular também um tubo contendo o meio base (sem adição do aminoácido) que servirá de controle.

Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.

Incubar a 36 ± 1ºC por, no máximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% não inoculado, que servirá de controle negativo.

Examinar os tubos todos os dias.

Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose, e, ocorrendo a hidrólise da arginina, o meio retorna a cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono.

O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer.

O Vibrio parahaemolyticus não hidrolisa a arginina.

5.5.7 Prova da fermentação do manitol e arabinose

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%.

Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.

Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.

Após o período de incubação, observar a mudança de coloração dos meios de vermelho para amarelo, devido à fermentação dos açúcares e conseqüente produção de ácido.

99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol.

50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose.

5.5.8 Teste do halofilismo

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%.

Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.

Após o período de incubação, observar a presença de turvação nos meios.

O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e não cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal.

5.5.9 Sensibilidade do agente vibriostático O/129

Esta prova é utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus.

Embeber um swab previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal 3% e inocular uma placa contendo ágar Müeller-Hinton sal 3% ou agar soja triptona sal 3%, espalhando bem o inóculo, de forma a obter um crescimento o mais homogêneo possível.

Deixar as placas absorverem o inóculo.

Colocar um disco do agente vibriostático O/129 com concentração de 10g e um disco de concentração de 150g.

Incubar as placas a 36 ± 1ºC por 24 horas.

O Vibrio parahaemolyticus é resistente à concentração de 10g de agente vibriostático O/129 enquanto o V. vulnificus é sensível.

Todos os víbrios são sensíveis à concentração de 150g do agente O/129.

6. RESULTADOS

Serão consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificação:

Motilidade - positiva

Hugh Leifson (OF) - glicose fementativo

Descarboxilação da lisina - positivo

Hidrólise da arginina - negativo

Crescimento a 42ºC - positivo

Fermentação do manitol - positivo

Fermentação da arabinose - positivo

Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 - 10g - resistente

Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 - 150g - sensível

Ágar gelatina sal 3% - crescimento com formação de halo

Halofilismo (6% sal) - positivo

Halofilismo (8% sal) - positivo

Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto

A partir da combinação de tubos com resultado positivo em cada série, calcular o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, "Procedimentos Básicos de Contagem", deste Manual.

Expressar o valor obtido em NMP/g.

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others víbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http: www.cfsan.fda.gov.

MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed. Lippincott Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169.

CAPÍTULO XIII
NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS AERÓBIOS VIÁVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAÇÃO EM PRODUTOS LÁCTEOS UHT E ESTERILIZADOS, PASTOSOS E VISCOSOS

1. OBJETIVOS E ALCANCE

Estabelecer procedimento para a determinação do NMP de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis, com exclusão daqueles comprovadamente não patogênicos e não causadores de alterações físicas, químicas e organolépticas em produtos lácteos pastosos e viscosos.

Detectar a presença de Bacillus sporothermodurans para diferenciá-lo dos demais microrganismos mesófilos aeróbios viáveis.

Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos tratados pelo processo UHT e produtos esterilizados.

2. FUNDAMENTOS

2.1 Pré-incubação

Baseia-se na incubação das amostras em estufa a 36 ± 1ºC por 7 dias e posterior verificação da ocorrência de alterações das características do produto.

2.2 Determinação do NMP

Baseia-se na semeadura de diluições seriadas da amostra em tubos contendo caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE), seguida de incubação a 30 ± 1ºC por 72 horas, com posterior repique em ágar cérebro-coração (BHI) e ágar nutriente isento de extrato de levedura e a subseqüente identificação da flora presente.

3. REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;

Ágar cérebro-coração (ABHI);

Ágar nutriente isento de extrato de levedura;

Ágar esculina;

Ágar uréia;

Caldo cérebro-coração nitrato (BHI-NO3);

Caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE);

Caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentração dupla (BHI-SE2);

Caldo vermelho de fenol com glicose;

Solução salina peptonada 0,1%;

Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;

Peróxido de hidrogênio 3%;

Alfa-naftilamina 0,5%;

Ácido sulfanílico 0,8%;

Zinco em pó;

Etanol 70% ou Etanol 70º GL;

Reagentes para coloração de Gram.

4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.

5. PROCEDIMENTOS

5.1 Preparo da amostra

Após pré-incubação, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com solução desinfetante e posteriormente com etanol 70% ou etanol 70º GL. Deixar secar.

Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.

Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.

A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, "Diluições e soluções", deste Manual.

5.2 Procedimentos de controle

Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.

5.3 Inoculação

Inocular 10 mL da diluição 10-1, 1 mL da diluição 10-1 e 1 mL da diluição 10-2, separadamente, em três séries de três tubos contendo 10 mL de BHI-SE. Na primeira série de tubos, que foram inoculados com 10 mL da diluição 10-1, usar o meio com concentração dupla (BHI-SE2).

Incubar a 30 ± 1ºC por 72 horas.

5.4 Confirmação do crescimento

Finalizado o período de incubação, repicar todos os tubos sobre a superfície seca de ABHI e de ágar nutriente isento de extrato de levedura, estriando de forma a obter colônias isoladas.

Incubar a 30 ± 1ºC por até 72 horas.

5.5 Leitura

O crescimento nas placas será indicativo de presença de mesófilos aeróbios no tubo de origem, porém será necessária a diferenciação entre Bacillus sporothermodurans (que não é patogênico nem produz alteração do produto) e outros mesófilos aeróbios capazes de alterar o alimento. Registrar o número de tubos que apresentaram crescimento de colônias nas placas correspondentes, registrando em separado as colônias suspeitas de Bacillus sporothermodurans.

Quando o crescimento bacteriano for devido à presença de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em análise, será observado crescimento abundante de colônias lisas, de forma regular, com coloração entre branco e bege, com diâmetro máximo de 3 mm, facilmente identificáveis, nas placas com ABHI.

No ágar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente não forma colônias visíveis, porém poderão se desenvolver colônias puntiformes de coloração entre branco e bege.

Selecionar de 2 a 3 colônias correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar para tubos com ABHI inclinado.

Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas e realizar os seguintes testes confirmatórios:

5.6 Coloração de Gram

Preparar esfregaço das colônias suspeitas e corar pelo método de Gram.

Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme o item 5.7.

Quando forem observados microrganismos com morfologia e características diferentes de bastonetes Gram positivos, considerar o tubo correspondente como positivo para presença de aeróbios mesófilos.

5.7 Catalase

Com auxílio de alça de platina, palito de madeira, bastão de vidro ou Pipeta de Pasteur, estéreis, transferir a cultura para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.

A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.

A maioria dos membros do gênero Bacillus apresenta reação de catalase positiva.

Quando a coloração de Gram demonstrar a presença de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, proceder à confirmação da presença de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, hidrólise da esculina, fermentação da glicose, redução do nitrato, produção de urease e crescimento em anaerobiose, conforme abaixo descrito.

5.8 Oxidase

Usando alça de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plástico descartáveis, estéreis, realizar a prova da oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponíveis.

Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após esse tempo, reações falso positivas podem ocorrer.

O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.

Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço inoxidável para realizar a prova de oxidase pois traços de óxido de ferro na superfície flambada pode produzir reação falso positiva.

O Bacillus sporothermodurans apresenta reação de oxidase positiva.

5.9 Crescimento em anaerobiose

Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 72h.

O Bacillus sporothermodurans não cresce em anaerobiose.

5.10 Hidrólise da esculina

Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo ágar esculina inclinado.

Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.

A hidrólise da esculina é evidenciada pelo enegrecimento do meio.

O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.

5.11 Fermentação da glicose

Semear tubos de caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose.

Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.

A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentação do açúcar presente.

O Bacillus sporothermodurans não fermenta a glicose.

5.12 Redução de nitrato

Inocular a cultura, com alça, em tubos contendo caldo BHINO3.

Incubar a 36 ± 1ºC por 72 horas.

Após incubação, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfanaftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de ácido sulfanílico 0,8%.

O aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato.

Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar ao tubo alguns miligramas de pó de zinco. Nesta situação, o aparecimento de coloração rosa indica reação negativa enquanto que o não desenvolvimento de cor indica positividade.

O Bacillus sporothermodurans não reduz o nitrato à nitrito.

5.13 Prova da urease

Inocular com alça a superfície de placas ou tubos com ágar uréia previamente preparadas.

Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.

Observar o crescimento com mudança de coloração para rosa intenso, o que indica positividade para produção de urease.

O Bacillus sporothermodurans não produz urease.

6. RESULTADOS

Considerar positivos os tubos que apresentaram crescimento de outras bactérias diferentes do Bacillus sporothermodurans e considerar como negativo quando não for observado crescimento de colônias nas placas e quando o crescimento observado for confirmado como sendo somente de Bacillus sporothermodurans.

A partir dos resultados obtidos, consultando a tabela de NMP apropriada e seguindo as instruções contidas no Anexo III, "Procedimentos básicos de contagem", deste Manual, calcular o número mais provável de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis presentes na amostra em análise.

Quando for confirmada a presença de Bacillus sporothermodurans juntamente com outros mesófilos na amostra, deverão ser excluídos os tubos que continham apenas Bacillus sporothermodurans para o cálculo final do NMP de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis.

Quando for observada somente a presença de colônias de Bacillus sporothermodurans na amostra, reportar o resultado de mesófilos aeróbios viáveis como 110 NMP/g ou mL e 930 NMP/g ou mL).

O resultado>110 NMP/g ou mL é vago e pode não ser adequado para a tomada de decisão a respeito do destino do lote a que se refere o alimento analisado, especialmente quando há uma tolerância em números maiores que este.

Exemplo 5: Nos casos de inoculação em que se utilizam 5 diluições em séries de 3 tubos e que apresente os resultados abaixo:

100 3 tubos positivos

10-1 3 tubos positivos

10-2 1 tubo positivo

10-3 0 tubos positivos

10-4 0 tubos positivos

Considerar o arranjo 3-1-0, já que o resultado mais próximo do real é obtido quando a primeira série considerada contém os 3 tubos positivos e a última série os 3 tubos negativos.

b) Inoculação de mais de 3 diluições seriadas em que ocorreram tubos positivos em mais de duas diluições subseqüentes à escolhida.

Neste caso, repassar um tubo positivo da maior diluição positiva para a imediatamente anterior, sucessivamente, até obter arranjo de tubos que se enquadre na situação anterior (casos 5 e 6 da tabela 1).

Exemplo 6: Amostra de alimento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo, apresentando os seguintes resultados:

100 3 tubos positivos

10-1 3 tubos positivos

10-2 2 tubos positivos

10-3 1 tubo positivo

10-4 1 tubo positivo

O resultado final, neste caso, será o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-2 tubos positivos.

Este arranjo é obtido pela transposição do tubo positivo da diluição 10-4 para a diluição anterior.

Exemplo 7: Amostra de alimento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo, apresentando os seguintes resultados:

100 3 tubos positivos

10-1 2 tubos positivos

10-2 0 tubos positivos

10-3 1 tubo positivo

10-4 0 tubo positivo

O resultado final, neste caso, será o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-1 de tubos positivos.

Esse arranjo de tubos positivos é obtido pela transposição do tubo positivo da diluição 10-3 para a diluição 10-2.

c) Nos casos de inoculação em que se utilizam 5 diluições em séries de 3 tubos, cujos resultados indicam duas possibilidades de todos os tubos da primeira série serem positivos e todos os da última série serem negativos, considerar o maior valor de NMP apresentado pela tabela correspondente.

100 3 tubos positivos

10-1 3 tubos positivos

10-2 0 tubos positivos

10-3 0 tubos positivos

10-4 0 tubos positivos

3-3-0 - 24 NMP/g ou mL (100, 10-1 e 10-2)

3-0-0 - 23 NMP/g ou mL (10-1, 10-2 e 10-3)

O resultado final, neste caso, será o valor NMP correspondente ao arranjo 3-3-0 (24 NMP/g ou mL).

d) Inoculação de somente 3 diluições seriadas

Nos casos de inoculação de somente 3 diluições seriadas, fazer a leitura diretamente na tabela (casos 1 e 4 e exemplo 4).

e) Arranjos inexistentes nas tabelas

Repetir a análise sempre que os resultados dos controles aplicados no processo analítico apontarem para esta necessidade, e/ou os arranjos de tubos positivos, na série de tubos múltiplos, revelarem comportamento incoerente como 0-1-3 ou outros arranjos inexistentes nas tabelas de NMP.

f) Atendendo a legislação

Utilizar a inoculação de 3 séries de 10, 5 ou 3 tubos quando a legislação estabelecer padrão para NMP menor que 1,0, 2,0 ou 3,0, respectivamente.

2.3 Tabelas de NMP

Tabela 1. Número Mais Provável por grama ou mL, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiança 95%.

Número de Tubos Positivos			NMP/g ou mL	Intervalo Confiança (95%)
0,1	0,01	0,001		Inferior	Superior
0	0	0	1100	420	-

Fonte: Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.

OBS.: Para obter o NMP/g ou mL, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise.

Tabela 2. Número Mais Provável por 100mL, para séries de 3 tubos com inóculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL, e respectivos intervalos de confiança 95%.

Número de Tubos Positivos			NMP/100mL	Intervalo Confiança (95%)
10	1,0	0,1		Inferior	Superior
0	0	0	1100	420	-

Fonte: Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.

Tabela 3. NMP por grama ou mL para séries de 10 tubos com inóculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1mL e respectivos intervalos de confiança 95%.

Número de Tubos Positivos			NMP/100mL	Intervalo Confiança (95%)
10	1,0	0,1		Inferior	Superior
0	0	0	2300	1300	--

Fonte: Adaptado Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.

3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicas para alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2ª revisão. 136p.

MATURIN,L.J.; PEELER, J.T. Aerobic Plate Count. In: Bacteriological Analytical Manual. 8 ed. Arlington, AOAC International, 1995. p. 3.01 - 3.10.

SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture Methods for Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001. p. 53-62.

FDA. Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov

ANEXO IV
PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLÔNIAS

1. INTRODUÇÃO

A aplicação de procedimentos de controle durante o processo analítico visa à garantia da confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, precisão e exatidão.

A precisão e a exatidão do método também dependerão da correta observação e aplicação dos procedimentos padronizados estabelecidos para a área analítica.

A garantia da validade dos resultados da contagem estará assegurada quando os resultados dos controles indicarem não haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analítico.

2. RECOMENDAÇÕES GERAIS

2.1 Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluição, seja duas ou mais diluições diferentes.

2.2 As contagens deverão ser realizadas imediatamente após o período de incubação das placas.

2.3 Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente após o período de incubação, manter as placas sob refrigeração em temperatura de 4ºC a 7ºC por um período não superior a 24 horas.

Esse procedimento não deve tornar-se uma prática rotineira.

2.4 Para a contagem, selecionar placas que contenham um número de colônias que se encontre dentro do intervalo de precisão e repetibilidade estabelecido pelo método em uso (por exemplo, 20 a 200 colônias, 25 a 250 colônias, etc.).

2.5 As colônias deverão ser contadas com o auxílio de contador de colônias equipado com placa de vidro ou acrílico, com diâmetro compatível com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm² de área e com iluminação artificial uniforme.

2.6 O contador de colônias deverá ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrônico ou manual de registro das contagens.

2.7 O contador de colônias deverá estar localizado em local onde não haja incidência direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possíveis enganos na identificação das colônias.

2.8 Utilizar o estereoscópio para observação de características morfológicas das colônias, para diferenciar microrganismos de partículas da amostra ou do meio e para seleção e isolamento de colônias.

2.9 Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluições sucessivas.

3. REGRAS GERAIS PARA CÁLCULO E REGISTROS

3.1 Expressão de resultados de contagem

No cálculo das contagens, o resultado final será expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta a diluição empregada, da seguinte maneira:

R = a x 10b UFC/g ou mL

R = resultado

a = os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9

b = expoente (0 a 10)

UFC = unidade formadora de colônias

g = grama e mL = mililitro

Exemplos:

Diluição 10-2 (1:100)

Média das contagens: 25 UFC

Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL

Diluição 10-3 (1:1.000)

Média das contagens: 38 UFC

Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL

O resultado final será expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos, separados por vírgula. Os algarismos subseqüentes, quando existirem, deverão ser arredondados e transformados em potência de 10.

3.2 Arredondamento de resultados

Quando se fizer necessário, e visando não criar uma falsa idéia de precisão, aplicar a seguinte regra para a aproximação dos resultados:

3.2.1 Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente após for superior a 5.

Exemplo:

Diluição 10-2

Média das contagens: 186 UFC

Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado:

190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL

3.2.2 Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente após for inferior a 5.

Exemplo:

Diluição 10-2

Média das contagens: 184 UFC

Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado:

180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL

3.2.3 Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqüente for igual a cinco, arredondar para baixo quando o segundo ou o subseqüente for menor ou igual a 5 e para cima quando for maior que 5.

Exemplos:

Diluição 10-2

Média das contagens: 185 UFC

Arredondando o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado:

190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL

Média das contagens: 145 UFC

Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado:

140 x 100 = 14.000 = 1,4 x 104 UFC/g ou mL

Média das contagens: 155 UFC

Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado:

150 x 100 = 15.000 = 1,5 x 104 UFC/g ou mL

3.2.4 Arredondamento de resultados obtidos pela contagem de placas em duplicata de duas diluições diferentes.

Nas contagens de placas de duas diluições diferentes, o procedimento de arredondamento é semelhante ao da contagem de mesma diluição, isto é, só poderá ser efetuado após o cálculo da média das contagens, que será explicado a seguir nas regras específicas para contagem de colônias.

3.3 Resultados estimados

Nas contagens, em que em todas as placas o número de colônias encontrado estiver fora do intervalo de precisão e repetibilidade da metodologia aplicada, incluir no registro do resultado final a expressão "estimado" ou "por estimativa", por meio da abreviatura " est.", após o g ou mL.

Quando houver condições para efetuar a contagem, expressar o número obtido. Pode-se ainda expressar o resultado como o limite inferior com o sinal de menor ou o superior com o sinal de maior, por estimativa ou estimado.

Exemplos, com limite entre 15 e 150:

Diluição 10-2

Média das contagens: 160 UFC

Resultado: 160 x 100 = 16.000 = 1,6 x 104 UFC/g ou mL est.

ou>1,5 x 104 UFC/g ou mL est.

Média das contagens: 11 UFC

Resultado: 11 x 100 = 1.100 = 1,1 x 103 UFC/g ou mL est.

ou ) o número obtido.

Exemplo:

Placa de área de 56 cm2.

Diluições usadas: 10-2, 10-3 e 10-4.

Observou-se mais de 100 colônias por cm2 nas placas onde foi inoculada a maior diluição.

56 x 100 x 10.000 = 56.000.000

Resultado final => 5,6 x 107 UFC/g ou mL est.

OBS: Nas situações descritas acima, nos itens 4.2 e 4.3, o resultado também pode ser expresso como "maior que 250 vezes a maior diluição utilizada". Expressar o resultado como número estimado.

Exemplo:

10-2 (> 250)

10-3 (> 250) => 2.500.000

10-4 (> 250)

Resultado:> 2,5 x 106 UFC/g ou mL est.

4.4 Placas com colônias invasoras

4.4.1 Quando a área invadida exceder 1/4 da área total, expressar o resultado como "presença de colônias invasoras".

4.4.2 Quando a área invadida for inferior a 1/4 da área total, contar tanto as invasoras como as normais. Quando as colônias invasoras estiverem aglutinadas, contar como uma colônia e quando estiverem isoladas, contar uma a uma.

4.5 Contagem incoerentes

Quando o resultado da contagem da maior diluição for duas ou mais vezes maior que o resultado obtido na diluição anterior, ou o da menor diluição for duas ou mais vezes maior que o resultado obtido na diluição posterior, considerar como resultado final o valor da menor diluição.

Exemplo 1:

Dil: 10-2 = 140 colônias (14.000)

Dil: 10-3 = 52 colônias (52.000)

Resultado: 1,4 x 104 UFC/g ou mL

Exemplo 2:

Dil: 10-2 = 95 colônias (9.500)

Dil: 10-3 = 2 colônias (2.000)

Resultado: 9,5 x 104 UFC/g ou mL

4.6 Situações nas quais todas as placas encontram-se com números de colônias abaixo dos limites do intervalo de precisão e repetibilidade.

Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleção de placas com número de colônias contido no intervalo de precisão e repetibilidade de 25 a 250 colônias.

Neste caso, o resultado deve ser expresso pelo número de colônias da placa de menor diluição, por estimativa.

Exemplo:

Dil: 10-2 = 21 UFC

Dil: 10-3 = 2 UFC

21 x 100 = 2.100

Resultado 2,1 x 103 UFC/g ou mL est.

4.6.1 Situações nas quais todas as placas não apresentem crescimento de colônias, independente do intervalo de seleção Quando em nenhuma placa for observado o crescimento de colônias, emitir o resultado como estimado: